| 抗生素与细菌耐药性机制及其对策 | |
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顾觉奋 （中国药科大学，南京210009） 1 细菌耐药性概述 1929年Fleming发现青霉素随后由Florey和Chain用于临床取得惊人的效果，这标志着抗生素时代的到来，它使人类的平均寿命延长了15年以上。但是，随着青霉素的广泛应用，发现了耐药菌的产生。1941年用2万单位青霉素能够控制的感染逐步上升到用20万、100万甚至更高的单位才能控制，人们第一次把细菌耐药性的问题提到重要的日程。科学家不断地开发出了半合成抗生素，有力地解决了当时的细菌耐药性问题。但是，随着更多的抗生素特别是第二代和第三代头孢菌素的广泛使用，产生了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin resistant staphylococcus aureus,MRSA），它对许多抗生素产生耐药性。细菌耐药性问题又第二次提到了重要的日程。 自从临床上出现了MRSA和其他耐药菌，使人们的生命受到了严重的威胁，人类的寿命可能被缩短。据统计，1992年美国13 000人死于耐药菌的感染，1995年临床发现的葡萄球菌有96%是耐药菌。国内资料表明，1998年的MRSA出现频率比1996年高3倍，耐青霉素的肺炎链球菌(penicillin resistant streptococcus pneumoniae,PRSP)的出现频率高达30%。一度曾用链霉素和利福平治愈的结核病，近年来出现了耐药性结核分枝杆菌，成为临床医生难以对付的“超级细菌”。 可以毫不夸张地说，细菌耐药性是21世纪全球关注的热点，它对人类生命健康所构成的威胁绝不亚于艾滋病、癌症和心血管疾病。 细菌对抗生素的耐药机制分4类： （1）细菌产生一种或多种水解酶或钝化酶来水解或修饰进入细菌胞内的抗生素使之失活，导致耐药；（2）抗生素作用的靶位(如核糖体和核蛋白)点发生突变使抗生素无法发挥作用，或被修饰使之与抗生素的结合不紧密，亲和力下降；（3）细菌具有一种依赖于能量的主动运机制，即能将已经进入胞内的抗生素泵至胞外，即外排泵的耐药机制；（4）细菌细胞膜发生改变，致使对抗生素的通透性降低，细菌菌膜(biofilm)的形成，使抗生素无法进入胞内的耐药机制。图1为药物进入细菌胞内的途径和细菌产生耐药性的各种可能机制。 图1 细菌对不同抗菌药物产生耐药性的可能机制 1-药物传递 2-药物转入 3-药物外排 4-药物活化 5-药物去毒 6-药物钝化 7-被破坏的靶位 8-靶位9-靶 位功能受阻 10-药物 11-修复效应 12-细胞周期效应 13-保护性修饰 14-靶位扩增 15-无功能的靶位 16-被修饰的靶位 17-靶位数量增加(以此维持活性) 2 细菌产生钝化酶的耐药机制 2.1 β-内酰胺酶与β-内酰胺酶抑制剂的开发应用 1940年青霉素在临床上试用，同年Abrahm等首次报告了细菌能产生破坏青霉素的β-内酰胺酶。直到1944年，首次报告了耐青霉素金葡菌产生的β-内酰胺酶。10年之后，从波士顿城市医院住院病人中分离的金葡菌，对青霉素耐药高达73%。至1975年，马萨诸塞州总医院84%的住院病人和83%的门诊病人分离出的金葡菌对青霉素耐药。估计，目前世界范围内均有90%以上的金葡菌对青霉素耐药。 随着新β-内酰胺类抗生素的临床使用，新的β-内酰胺酶也不断产生，如广谱半合成青霉素氨苄西林、羧苄西林以及20世纪60年代第一个使用的头孢菌素，甚至20世纪70年代使用的头孢菌素，均诱发了肠杆菌属和其它革兰阴性菌质粒介导β-内酰胺酶。后来，更新的头孢菌素、头霉素、单酰胺类和碳青霉烯类等广泛应用于临床，引起了更多革兰阴性细菌质粒或染色体介导的TEMβ-内酰胺酶的产生。这些酶常在革兰阴性杆菌中由氨苄西林产酶基因(ampicillin C，ampC基因)编码。对头孢菌素类、头霉素类和广谱青霉素类如氨苄西林、阿莫西林和抗假单胞菌青霉素，均能产生一定的水解作用，明显降低了它们的抗菌活性。 细菌通过产生钝化酶破坏进入胞内的抗生素是耐药菌具有的耐药机制。β-内酰胺酶是一大类能破坏有β-内酰胺结构抗生素的钝化酶总称。这些酶通常通过活性丝氨酸位点与β-内酰胺类抗生素结合，β-内酰胺环内的环形胺键被丝氨酸的羟基水解，β-内酰胺环的开环形式不能与其靶位点结合，因此失去抗生素活性。在革兰阳性球菌中，惟一有重要临床意义的β-内酰胺酶是葡萄球菌β-内酰胺酶，它能快速水解青霉素G、氨苄青霉素、羟氨苄青霉素、羧苄青霉素和相关的制剂。 在20世纪80年代中期法国和德国突然出现，由于肺炎克雷伯杆菌对那些原来被认为对β-内酰胺酶非常稳定的头孢氨噻肟、头孢三嗪或头孢他啶产生耐药性而使治疗失败的事件。导致产生耐药性的原因是由于产生了新的β-内酰胺酶，如CTX-1，它能优先破坏头孢氨噻肟；CAZ-1能优先破坏头孢他啶。铜绿假单胞菌是引起许多病人严重感染的主要原因，尤其是白血球显著降低的病人更为严重。所有的铜绿假单胞菌都具有一种由染色体介导的，且可以诱导的头孢菌素酶。另外其他一些对β-内酰胺酶稳定的头孢菌素类抗生素可以诱导产生大量的β-内酰胺酶，从而最终将药物破坏。这些β-内酰胺酶对于铜绿假单胞菌来说被简 称为PSE。β-内酰胺抗生素与革兰阳性菌(A)和革兰阴性菌(B)的相互作用示意图见图2。 图2 β-内酰胺抗生素与革兰阳性菌(A)和革兰阴性菌(B)的相互作用示意图 由图2所示，β-内酰胺酶既能够存在于革兰阳性菌中，也能够存在于革兰阴性菌中，因而它对细菌的耐药性似乎所起的作用更大。革兰阳性菌对β-内酰胺抗生素的耐药性主要由β-内酰胺酶和PBPs的亲和力降低所致；而革兰阴性菌对β-内酰胺类的耐药性主要由β-内酰胺酶和细胞膜渗透性屏障(抗生素难以透过)所致，或由质粒、染色体介导的β-内酰胺酶将已经进入胞内的β-内酰胺抗生素降解，使其失去生物活性而产生耐药性。 根据这一机制进行新药研究的策略已取得显著效果的有两个： 2． 1．1 筛选具有对β-内酰胺酶稳定的半合成的抗生素 对β-内酰胺酶稳定的抗生素如甲氧西林、苯唑青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素、氟 氯青霉素等半合成青霉素类抗生素；第一代、第二代、第三代、第四代头孢菌素类抗生素；亚胺培南、帕尼培南、美洛培南等碳青霉烯类抗生素，对临床上产β-内酰胺酶细菌引起的感染起到了一定的作用。目前，基于这一研究策略仍是新药研究开发的重要途径。 2．1．2筛选对β-内酰胺酶具有抑制作用的特异性酶抑制剂 20世纪70年代中期棒酸的发现，开创了酶抑制剂的新领域。目前已经非常成功地研究 开发了β-内酰胺酶抑制剂的临床应用，其机制在于这些β-内酰胺酶能够与酶抑制剂形成不可逆的共价复合物，从而使β-内酰胺类抗生素发挥正常生物活性。通过对作用机制的探讨，使受β-内酰胺酶而失效的药物重新发挥了作用，并取得了令人瞩目的效果。 ① 临床应用的β-内酰胺酶抑制剂 1976年英国Beechem公司从棒状链霉菌的代谢产物中分离得到了具有强β-内酰胺酶抑制作用的药物，定名为克拉维酸(clavulanic acid或称棒酸)。它本身的抗菌活性很弱，但与羟氨苄青霉素组成的奥格门汀、与羧噻吩青霉素组成的泰门汀，都具有很好的协同作用。前者为口服给药，后者为注射用药，国外自20世纪80年代初应用于临床，国内现也已投放市场。 1978年Englikh等报道了青霉烷酸及其砜类的β-内酰胺酶抑制剂。其中青霉烷砜(舒巴坦)就是一个很好的β-内酰胺酶抑制剂。它本身不具抗菌活性，但它在较低的浓度时，对多种类型酶都具有很强的不可逆抑制作用。优立新是氨苄青霉素与青霉烷砜(舒巴坦)组成的复合剂，舒普深是头孢哌酮与青霉烷砜(舒巴坦)组成的复合剂，这两个品种均已上市。 日本大鹏药品公司开发的他佐巴坦(tazobactam)是第三个已被应用于临床的β-内酰胺制剂，它是青霉烷砜取代甲基衍生物，其特点是抑酶谱广，抑酶谱的广度与抑酶活性的强度都优于克拉维酸与舒巴坦。他佐西林(tazocillin)是氧哌嗪青霉素与他佐巴坦组成的复合剂，它可以使原来对氧哌嗪青霉素耐药的众多革兰阳性、阴性菌和厌氧菌株变为敏感菌。 应用于临床的β-内酰胺酶抑制剂有：克拉维酸、舒巴坦和他佐巴坦等，与这些酶抑制剂组成的复合剂有：奥格门丁augumentin (羟氨苄青霉素与棒酸)；替门丁timentin (羧噻吩青霉素与棒酸)；优立新unasyn (氨苄青霉素钠与舒巴坦钠)；舒他西林sutamicillin (氨苄青霉素与舒巴坦)；舒哌酮sulperazon (头孢哌酮钠与舒巴坦钠)；舒噻肟sulotaxime (头孢噻肟与舒巴坦钠)；他佐西林tazocillin (氧哌嗪青霉素与他佐巴坦钠)。 表1 各国应用的β-内酰胺酶抑制剂的制剂
② β-内酰胺酶抑制剂的作用机制 其原理是β-内酰胺酶能与酶抑制剂形成不可逆的共价复合物，从而使β-内酰胺类抗生素发挥正常作用。由于形成的共价复合物是不可逆的，因而被称为“自杀性抑制剂”。 以克拉维酸为例，克拉维酸与β-内酰胺酶相互作用是复杂的。但总的来说，其与酶的作用过程包括两个步骤，即抑制和灭活。克拉维酸对β-内酰胺酶的活性位点有高亲和力，能与催化中心相结合，以竞争性抑制剂的方式发挥作用。随后与酶分子中丝氨酸的羟基发生反应，通过β-内酰胺羰基和β-内酰胺环打开而使酶酰化。由于β-内酰胺环的水解及随后的噁唑烷环打开暴露出了反应基团，在活性部分形成稳定的共价键而灭活。 2．2 氨基糖苷类抗生素钝化酶与对策 临床发现的革兰阴性杆菌和阳性球菌对于氨基糖苷类的耐药性，很多缘自能改变氨基糖苷类抗生素分子的氨基或羟基的可转录的质粒介导的酶。改变了的抗生素分子不能结合于核糖体的靶蛋白，亦即使其与作用靶位核糖体的亲和力大为降低，因而导致耐药。 氨基糖苷类抗生素钝化酶通常由质粒和染色体所编码，同时与可动遗传因子(整合子、转座子)也有关，质粒的交换和转座子的转座作用都有利于耐药基因掺入到敏感菌的遗传物质中去。其作用机制是对氨基糖苷类抗生素分子中保持活性的基团——氨基或羟基进行共价修饰。这些钝化酶包括N乙酰基转移酶(aminoglycoside acetyltrasferases，AAC)、腺苷转移酶(aminoglycoside adenyltrasferases，AAD)、核苷转移酶(aminoglycoside-necleotidyltrasferases，ANT)和磷酸转移酶(aminoglycoside phosphotrasferases，APH)等。它们的活性谱极为不同，它们使不同的氨基糖苷类抗生素失活能力也不一样。 目前，临床上使用的半合成氨基糖苷类抗生素都是根据细菌产生耐药性的机制进行结构改造而研制得到的。利用已有的氨基糖苷类抗生素修饰酶的知识，可对现有的抗生素进行有效的改造，以减少酶对它们的识别而仍然保持其内在活性，在这一方面已取得了一定的成效，较为突出的有卡那霉素分子上引进保护基因以免钝化酶修饰的丁胺卡那霉素，去除易被钝化酶修饰基因的地贝卡星，还有两者同时兼有的I-N位取代的阿贝卡星等。 新一代氨基糖苷类抗生素有着三维结构，这种设计防止它们与多种修饰酶相结合，而且 使得借助一种酶学机制对某种氨基糖苷耐药的微生物可能仍然保持了对其他氨基糖苷类抗生素的敏感性。 2．3 MLS类抗生素钝化酶 机制基本相同。 红霉素酯酶专一性地水解14元环如红霉素和竹桃霉素的大环内酯部分。林可霉素类钝化酶在葡萄球菌和乳酸杆菌中发现有，可使4位羟基磷酸化或核苷酰化而失活。链阳性菌素耐金葡菌有两个耐药基因：一个是编码链阳性菌素A 的O-酰基转移酶基因saa；另一个编码链阳性菌素B水解酶基因sbh。 2．4 氯霉素类抗生素钝化酶 革兰阳性细菌和阴性细菌对氯霉素产生耐药性的主要作用机制是细菌产生的O-酰化酶即氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyltrasterase，CAT)，它能将氯霉素分子中的游离羟基酰化转化成单乙酸盐或双乙酸盐。这些衍生物不能与细菌的50S核糖体亚单位结合，因此不能产生正常情况下氯霉素抑制细菌转肽酶活性的作用。这种氯霉素乙酰转移酶基因广泛存在于革兰阳性细菌和革兰阴性细菌中。 3 药物作用靶位发生突变或被修饰的耐药机制 β-内酰胺类抗生素的作用靶位为青霉素结合蛋白(PBPs)；氨基糖苷类的作用靶位为50S核糖体；大环内酯类和克林霉素的作用靶位为30S核糖体；利福霉素类的作用靶位为DNA的RNA聚合体，见表2。 表2 药物作用靶位被修饰或发生变异而产生的耐药性
3．1 药物作用靶酶(靶蛋白) 发生突变或被修饰所产生的耐药机制 3．1．1青霉素结合蛋白(PBPs)的变化 细菌外壳上存在着一些蛋白，可与青霉素结合，称为青霉素结合蛋白(penicillin-binding proteins，PBPs)。β-内酰胺类耐药的细菌除了钝化酶破坏胞内抗生素外，还由于青霉素结合蛋白(PBPs)发生了改变，使其亲和力降低。PBPs是β-内酰胺类抗生素的靶位点，每种细菌细胞上有几种PBPs，因种属不同而不同。PBPs为酶类，如转肽酶、羧肽酶和肽链内切酶，它们是细胞生长过程中细胞壁合成和转变所需的酶。PBPs与β-内酰胺酶有关，但不同于β-内酰胺酶的是，PBPs与β-内酰胺形成稳定的复合物，其自身也失活。β-内酰胺类抗生素因此使 | ||||||||||||||||